mini prep 효율 올리는방법 있으면 알려주세요.
DNA plasmid mini prep 시 동일 한 sample을 동일하게 elution을 해도 제가하면 농도가 낮게 나오는데.. 테크닉이 부족한것 같습니다. prep 효율을 높일 수 있는 팁에 어떤것들이 있는지 또는 주의할점이 있다면 알려주세요.
안녕하세요.
효율을 높이기 위한 몇 가지 과정을 서술해보겠습니다. 그 중에 부합되거나, 누락된 내용이 있으면 참고하시면 좋을것 같습니다.
세균 배양이 적절한 양상에서 이루어지는지 확인해보세요. 이는 세포당 플라스미드 수를 최대화합니다. 통상적으로 밤샘 배양은 16-18시간을 넘지 않아야 합니다. 또, 세포의 완전한 용해가 이루어져야 DNA가 최적으로 추출됩니다. 용해 버퍼를 넣은 후에는 너무 세게 진탕하지 마세요. DNA가 파괴될 수 있습니다.
용해 단계에서는, 권장하는 배양시간을 준수하는게 중요합니다. 너무 짧게 되면 용해가 불완전하고, 너무 길어졌을 경우 플라스미드가 분해될 수 있습니다. 정제 과정 중 컬럼을 효과적으로 세척하여 단백질과 기타 오염물을 제거하되 플라스미드 DNA를 잃지 않도록 합니다. 용출 효율을 높이기 위해 용출 버퍼를 50~60°C로 데운 후에 사용하시길 추천드립니다. 더 높은 온도가 플라스미드 DNA의 수율을 증가시킬 수 있습니다. 또한, 용출 버퍼가 컬럼 매트릭스와 직접 접촉하도록 하시길 바랍니다.Mini prep에서 효율을 높이기 위해서는 몇 가지 중요한 팁과 주의사항을 따르는 것이 도움이 될 수 있습니다. 첫째, 세포 수를 적절히 사용해야 합니다. 너무 많은 세포를 사용하면 라이세이트가 점성이 높아져 DNA 추출이 어려울 수 있으므로, 권장량을 준수하는 것이 좋습니다. 둘째, 라이세스 단계에서 세포를 과도하게 또는 불충분하게 처리하면 효율이 떨어질 수 있습니다. 세포가 완전히 용해될 수 있도록 충분히 혼합하되, 너무 오래 방치하지 않도록 주의하세요. 셋째, 중합체 제거와 침전 과정에서 균형을 잘 맞추는 것이 중요합니다. 특히 플라스미드 DNA를 침전시킬 때, 이소프로판올이나 에탄올을 사용할 때 충분히 냉각하고, 침전 후에도 잘 세척하여 염을 제거해야 합니다. 마지막으로, elution buffer는 DNA가 잘 용출될 수 있도록 TE buffer나 저농도의 Tris-HCl을 적절한 pH(8.0)로 준비하는 것이 좋으며, 이를 37°C로 가열해 사용하면 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다.