protein 이 aggregation 되는 이유에는 어떤 것들이 있나요?
protein을 e.coli에서 발현하고, 정제하는 과정에서 aggregation이 발생하는데, 이러한 현상이 일어나는 이유에는 어떤것들이 있으며 방지하는 방법에는 어떤 메소드 들이 있을까요?
안녕하세요. 이상현 전문가입니다.
단백질끼리는 서로 강한인력이 존재하기때문에
응집하려는 성질이 발생합니다.
이를막기위한 몇가지방법은 다음과같습니다.
첫번째로 버퍼를 잘 선택하는것입니다.
pH에따라서 단백질응집정도가 달라지기때문에
산성도를 잘 구성해주는것이 좋습니다.
첨가제를 사용해도되는데
EDTA같은 것들을 넣어주면되지만
다른 물질을 넣지못하는 실험에는 적합하지 않습니다.
온도조절도중요한데
보통4도정도에서 작업하면 응집을 줄일수있습니다.
마지막으로 단백질 농도가 옅어지도록 벌크한
용매에서 소량의 단백질을 추출하는것이 좋습니다.
감사합니다.
안녕하세요. 김채원 전문가입니다.
단백질들은 정전기적인 결합력뿐아니라
서로 공유결합이 가능하고,
3차원으로접혀있는구조때문에
서로 엉겨붙고 달라붙는특성이 있습니다.
각 단백질의 작용기를 막은상태로 만들거나
전자기적 툴을 이용해 외부 기계적인 힘으로 각
단백질들을 붙잡아둘수 있는 시스템이 있으면 따로 분리가능합니다.
안녕하세요. 정준민 전문가입니다.
이콜라에서 단백질 발현시 AGGREGATION 이 발생하는 이유는 주로 단백질의 비정상적인 접힘, 높은 농도, 그리고 세포 내 환경이 원입니다.
이를 방지하기 위해 저온발현, 샤페론 단백질사용 등이 있어요
사실 대장균을 이용한 단백질 발현 시 응집 현상은 매우 흔하게 발생하는 문제입니다.
이는 단백질의 구조적 특성, 발현 조건, 정제 과정 등 다양한 이유로 발생할 수 있습니다.
어떤 실험인지를 정확히는 알지 못하기에...
만일 단백질 표면에 소수성 아미노산이 많이 노출될 경우, 물과의 상호 작용이 줄어들어 다른 단백질과의 소수성 상호 작용을 통해 응집이 발생하기 쉽습니다. 또 구조적으로 불안정한 단백질은 잘못 접히거나 부분적으로 변성되어 응집될 가능성이 높습니다.
만일 단백질이 과도하게 발현될 경우, 세포 내에 단백질 농도가 높아져 응집이 발생할 가능성이 증가하고 높은 온도는 단백질의 구조를 불안정하게 만들어 응집을 유발할 수도 있죠. 또한 산화 환경은 단백질의 디설파이드 결합 형성을 유도하여 응집을 일으킬 수 있습니다.
그리고 높은 이온 강도는 단백질의 용해도를 감소시켜 응집을 유발할 수 있고 앞서 산성을 말씀드리긴 했지만, pH가 너무 높거나 낮은 조건에서는 단백질의 전하가 변하여 응집이 발생할 수 있습니다.
또 유기 용매는 단백질의 소수성 부분과 상호 작용하여 응집을 유발할 수 있습니다.
응집 방지 방법이라면 앞서 말씀드린 원인을 제거해줘야 합니다.
낮은 온도에서 발현하면 단백질의 접힘이 느려져 올바른 구조를 형성할 가능성이 높고 chaperone 단백질이나 fusion tag을 함께 발현시켜 단백질의 접힘을 방지하는 것도 방법이죠. 물론 실험 시 단백질이 과도하게 발현되지 않도록 발현 시간을 조절합니다.
그리고 배지에 다양한 아미노산, 금속 이온, 보조 인자 등을 첨가하여 단백질의 안정성을 높이고 다양한 완충용액과 첨가제를 사용하여 단백질의 용해도를 높이는 것도 방법입니다.
사실 어떤 실험인지를 모르다보니..
간략하게나마 말씀드립니다.
단백질이 aggregation 되는 주된 이유는 비정상적인 접힘 때문입니다. e.coli에서 단백질 발현 시 고농도 발현이나 빠른 합성 속도로 인해 단백질이 올바르게 접히지 않고 응집될 수 있습니다. 다른 원인으로는 발현 중의 세포 스트레스, 고온 환경, 불안정한 단백질 구조 등이 있습니다. 방지를 위해서는 낮은 온도에서 발현을 시도하거나 발현 속도를 조절하는 낮은 농도의 유도제를 사용하며, 접힘을 돕는 molecular chaperones을 활용할 수 있습니다. 또한, 분리 단계에서 속도를 조절하고 보조제를 추가해 접힘을 안정화하는 방법도 있습니다.
안녕하세요.
단백질의 응집 현상은 대장균(Escherichia coli)을 포함한 많은 발현 시스템에서 흔히 발생하는 문제입니다. 이 현상의 주요 원인은 다양하며, 단백질의 특성, 발현 조건, 정제 과정에 의해 영향을 받습니다. 먼저, 주요 원인으로는 단백질의 과발현(overexpression)으로, 세포 내의 단백질 접힘 시스템(protein folding systems)이 과부하를 겪어 비정상적인 접힘이나 응집을 유발할 수 있습니다. 또, 발현된 단백질의 서열이 대장균 내에서 비자연적으로 느껴질 수 있어, 세포 환경과의 상호작용이 단백질 응집을 촉진할 수 있습니다. 세번째로는 발현과 정제 과정에서의 환경 조건, 온도, pH, 이온 농도와 같은 요인들이 단백질의 구조적 안정성을 저하시켜 응집을 유발할 수 있습니다.
이런 단백질 응집을 방지하기 위한 방법으로는, 온도를 낮춰서 단백질을 느리게 발현시키는 방법이 있습니다. 저온에서 단백질을 발현시키면 접힘이 더 정교하게 이루어져 응집을 방지할 수 있습니다. 또, 분자 샤페론(molecular chaperones)을 공동 발현시켜 단백질 접힘을 돕는 방법도 있습니다. 이 방법은 단백질의 올바른 접힘을 촉진하여 응집을 감소시킬 수 있습니다. 끝으로, 발현 및 정제 과정 중에 글리세롤이나 아르기닌과 같은 특정 용매를 추가하는 방법이 있습니다. 이 용매들은 단백질의 용해성을 향상시키고 비특이적 상호작용을 감소시킵니다.