cloning 에 필요한 primer를 design 하는 방법 알려주세요.
cloning을 하려고하는데요, vector sequence와 insert 로 넣을 target gene sequence는 가지고 있습니다. primer를 design 해야 하는데, 방법을 몰라서요 조금 구체적으로 방법알려주세요!
Cloning을 위한 primer를 설계하려면, target gene과 vector 서열을 기반으로 Forward와 Reverse primer를 각각 디자인해야 합니다. Forward primer는 insert의 5' 끝에서 시작하며 제한효소 인식 서열과 4-6bp의 overhang을 추가하고, Reverse primer는 insert의 3' 끝 상보 서열로 제한효소와 overhang을 포함해 설계합니다. 두 primer의 길이는 18-25bp, GC 함량은 40-60%, Tm은 55-65°C로 조정하며, 제한효소 서열이 target 내부에 중복되지 않도록 주의합니다. 설계 후 PCR primer design 소프트웨어를 활용해 Tm, GC%, 2차 구조 등을 확인하고, vector와 insert가 제대로 연결될 수 있는지 Restriction enzyme map을 검증한 뒤 primer를 주문하면 됩니다.
안녕하세요.
Cloning에 필요한 primer를 디자인하는 것은 성공적인 실험의 핵심입니다. 우선 Target gene과 벡터에 대한 이해가 필요합니다. Insert sequence: 클로닝하려는 target gene의 서열을 준비하시고, Vector sequence: 벡터의 전체 서열과 클로닝에 사용할 제한효소 자리(MCS: Multiple Cloning Site)를 확인해야 합니다. 각 primer는 두 가지 주요 목적을 충족해야 합니다. Insert를 증폭할 수 있어야 합니다 (PCR용). 두번째로는 벡터와 효율적으로 결합할 수 있도록 제한효소 자리를 포함해야 합니다. Forward primer의 경우 Target gene의 5' 말단에 결합하여, 제한효소 자리를 포함시키기 위해 추가적인 서열을 붙여야 합니다. Reverse primer의 경우 Target gene의 3' 말단에 결합하여, 제한효소 자리와 함께 Reverse complement 형태로 디자인해야 합니다. 다음으로 벡터의 MCS에서 사용 가능한 제한효소를 선택하셔야 하는데여, 이때 제한효소가 insert 서열에 등장하지 않아야 합니다. Primer를 디자인할 때 우선 Forward primer의 경우 Target gene의 시작점에서 약 18-24bp 정도를 선택하고, 5' 말단에 제한효소 서열(6-8bp)을 추가하며, 제한효소의 효율적 절단을 위해 제한효소 자리 앞에 GC-rich 서열(4-6bp)을 추가해야 합니다. 다음으로 Reverse primer의 경우 Target gene의 끝에서 약 18-24bp를 Reverse complement로 선택, 5' 말단에 제한효소 서열(6-8bp)을 추가하고 제한효소 앞에 GC-rich 서열을 추가해야 합니다. 또한 다음과 같은 요소들을 고려하는 것이 좋습니다. 길이: 18-24bp 권장.
Tm (녹는 온도): Forward와 Reverse primer가 비슷해야 하며, 일반적으로 55-65°C 범위가 적합
Tm 계산 공식: Tm=4×(G+C)+2×(A+T)
GC 함량: 약 40-60% 권장.
3' 말단 안정성: 3' 말단은 안정해야 하며, dimer 형성이나 hairpin 구조를 피하세요.