단백질 분리 정제시에 친화성 크로마토그래피의 단점은 무엇인가요?
안녕하세요. 단백질의 분리 정제할 때 가장 좋은 방법이 친화성 크로마토그래피라고 들었는데 단백질과 칼럼에 친화도가 너무 높아서 단점이 있다고 들었습니다. 그것이 무엇인지 궁금합니다.
안녕하세요.
네, 말씀해주신 친화성 크로마토그래피는 단백질과 특정 리간드(ligand) 사이의 높은 특이적 결합을 이용하여 표적 단백질을 선택적으로 분리하는 매우 강력한 방법인데요, 일반적으로 항체-항원 결합, 효소-기질 유사체 결합, His-tag와 Ni²⁺/Co²⁺ 결합 등이 활용되지만 그러나 장점이 큰 만큼 단점도 존재합니다. 우선 말씀하신 것처럼, 표적 단백질과 칼럼 리간드 사이의 결합력이 지나치게 강하면 단백질을 용리(elution)하기 어려움이 가장 큰 문제인데요, 이 경우, 단백질을 칼럼에서 분리하기 위해 높은 농도의 염, 극성 용매, pH 변화, 변성제 등을 사용해야 할 수 있으며, 이런 강한 처리 과정은 단백질의 구조적 변성(denaturation)이나 활성 손실을 초래할 위험이 있습니다. 또한 특정 단백질이 아닌 다른 단백질이 칼럼 리간드와 약하게 결합할 수 있어 순도가 낮아지는 경우가 있으며 특히 복합체 단백질이나 유사한 구조를 가진 단백질은 비특이적 흡착(non-specific binding)이 발생할 수 있습니다. 고특이성 리간드를 가진 친화성 칼럼은 제작 비용이 높고, 재사용이 제한적일 수 있으며, 강한 세척이나 용리 과정에서 리간드가 손상될 수 있어, 칼럼 수명이 줄어듭니다. 또한 단백질마다 최적 리간드, 결합 완충 용액, 용리 조건이 다르기 때문에 조건 설정이 번거롭고 시간이 많이 소요되며 특히, 용리 조건에서 단백질 안정성을 동시에 유지하는 것이 어려울 수 있습니다. 감사합니다.
1명 평가말씀하신대로 높은 친화도가 역설적으로 몇 가지 단점을 만들었는데, 그 중 가장 큰 단점은 결합된 단백질을 컬럼에서 분리하기 어렵다는 점입니다.
다시 말해 단백질이 칼럼에 너무 강하게 결합하면서, 단순히 pH나 염 농도를 조절하는 일반적인 용출 방법으로는 단백질을 분리해내기 어렵습니다.
결국 단백질을 분리하기 위해 고농도의 염이나 극단적인 pH, 또는 경쟁 리간드와 같은 강한 용출 버퍼를 사용해야 할 수 있습니다. 이러한 버퍼는 비용이 많이 들고, 실험 과정이 복잡해지며, 시간이 오래 걸릴 수 있습니다.
또한 강한 조건에서 용출하는 과정에서 목표 단백질의 활성을 잃거나 구조가 변성될 위험도 있습니다. 특히 효소나 다른 기능성 단백질의 경우 이는 치명적인 단점이 됩니다.
게다가 강한 용출 버퍼는 칼럼에 부착된 리간드나 지지체 자체를 손상시킬 수 있어, 칼럼의 재사용율이 떨어집니다.
그 외에도 리간드 누출, 비특이적 결합 등의 문제가 발생할 수도 있고, 무엇보다 높은 비용도 큰 단점이겠죠.
친화성 크로마토그래피의 주요 단점은 표적 단백질과 고정상 사이의 결합이 너무 강할 경우 용출이 어려워 단백질 회수율이 낮아질 수 있다는 점입니다. 또한, 비특이적 결합으로 인해 원치 않는 단백질이 함께 정제될 수 있고, 특이적인 결합을 유도하기 위한 리간드와 레진의 제작 비용이 높으며 재활용이 어렵다는 단점이 있습니다.