벡터의 self ligation은 어떻게 해결할 수 있나요?

Question

cloning에 사용할 vector를 한종류의 제한효소로 자르게 될 경우 벡터 스스로 self ligation될 가능성이 존재하는데 이를 해결할 수 있는 방법이 궁금합니다.

Answer 1

벡터의 self-ligation은 벡터 분자 자체가 염기서열 상에서 상호작용하여 끈을 맺는 현상을 의미합니다. 이는 잘못된 실험 조건이나 처리 방법으로 인해 벡터 분자가 의도하지 않은 방식으로 상호작용하여 자체적으로 연결되는 경우에 발생할 수 있습니다.

벡터의 self-ligation을 해결하기 위한 몇 가지 전략은 다음과 같습니다:

1. 효소 소거: Self-ligation은 대부분 DNA 끝에 있는 효소 인식 부위가 자체적으로 결합하는 것으로 인해 발생합니다. 이를 방지하기 위해 벡터 분자에 효소 소거 단계를 추가하여 염기서열 끝을 다양한 제한 효소로 소거해줄 수 있습니다.

2. 염기서열 수정: 벡터 분자의 염기서열을 약간 수정하여 효소 인식 부위를 변경하거나 제거할 수 있습니다. 이를 통해 self-ligation을 방지하고 의도된 분자 상호작용을 촉진할 수 있습니다.

3. 벡터 크기 조절: 벡터 분자의 크기를 조절하여 self-ligation이 발생하지 않도록 할 수 있습니다. 벡터 분자의 끝에 부착되어 자체 결합하는 부분이 없으면 self-ligation이 일어나지 않을 가능성이 높습니다.

4. 실험 조건 최적화: 실험 조건을 최적화하여 self-ligation을 최소화할 수 있습니다. 올바른 온도, 시간, 효소 농도 등을 설정하여 의도하지 않은 상호작용을 최소화하고 목표 분자의 생성을 촉진할 수 있습니다.

5. 길이 분석: 생성된 벡터 분자들을 전기영동 또는 크로마토그래피와 같은 방법을 사용하여 길이 분석을 실시합니다. 이를 통해 self-ligated 벡터와 의도된 분자를 구분하고 성공적인 분자 생성을 확인할 수 있습니다.

위의 전략들을 적절하게 조합하거나 실험 조건을 최적화하여 self-ligation을 해결하고 원하는 벡터 분자를 얻을 수 있습니다. 실험 시 주의 깊게 실험 조건을 설정하고 분석하여 의도하지 않은 현상을 방지하는 것이 중요합니다.

Answer 2

안녕하세요. 김재훈 전문가입니다.

벡터를 한 종류의 제한효소로 절단하면 양쪽 말단이 서로 맞아 다시 연결되는 self ligation이 발생할 수 있습니다 가장 흔한 해결법은 절단된 켁터의 5' 인산기를 제거하는 탈인산화 처리를 해 벡터끼리 연결되기 어렵게 만드는 것이 입니다 떠 가능하다면 서로 다른 두 제한효소를 사용해 양쪽 말단을 다르게 만드는 방향성 클로닝을 이용하면 self ligation을 크게 줄일 수 있습니다 다만 탈인산화한 벡터는 삽입 DNA와의 연결에는 필요한 말단 조건을 유지할 수 있으므로 적절한 대조군을 함께 두어 클로닝 결과를 확인하는 것이 좋습니다