유전자 재조합을 위해 cDNA를 만들 때 RNase는 소량 처리해야 되는 이유가 무엇인가요?
안녕하세요.유전자 재조합을 위해 대장균에 플라스미드 벡터에 유입할 cDNA를 만들 때 RNase는 소량만 처리해야 되는 이유가 무엇인가요?
안녕하세요. 정준민 전문가입니다.
cDNA 합성 후 잔여 RNA 를 제거하려 RNase를 쓰지만 과량이면 새로 만든 cSNA나 프라이머까지 손상시킬수 있답니다.
안녕하세요. 질문주신 것과 같이 유전자 재조합 과정에서 cDNA를 만들 때 RNase를 소량 처리하는 이유는 역전사 반응의 특성과 RNA–DNA hybrid의 역할과 관련이 있는 것인데요, 우선 cDNA를 합성할 때 역전사효소가 mRNA를 주형으로 하여 상보적인 DNA(cDNA)를 합성하는데, 이 단계에서 만들어지는 것은 RNA–DNA hybrid 즉 한 가닥은 RNA, 다른 가닥은 DNA인 이중가닥 구조입니다. 이때 역전사 후에는 RNA–DNA hybrid가 존재하게 되는데, 이 상태로는 이중가닥 DNA가 아니므로 바로 클로닝에 쓰기 어렵기 때문에 따라서 RNase H는 RNA–DNA hybrid에서 RNA 가닥을 부분적으로 절단하여 제거합니다. 이렇게 RNA 일부가 절단되면, 남아 있는 짧은 RNA 조각들이 프라이머 역할을 하여 DNA polymerase가 그 자리를 채우며 이중가닥 cDNA를 완성할 수 있습니다. 즉 RNase를 소량 처리하는 이유는 DNA polymerase가 필요로하는 프라이머를 제공하기 위함이라고 생각하시면 되겠습니다. 감사합니다.
RNase는 RNA를 분해하는 효소이기 때문입니다.
cDNA를 합성하기 위해서는 mRNA를 주형으로 사용해야 합니다. 역전사 효소가 이 mRNA 주형을 읽어 cDNA를 만들죠.
만약 RNase를 필요 이상으로 많이 처리하면, 아직 cDNA로 만들어지지 않은 주형 mRNA마저도 파괴될 수 있습니다. 이렇게 되면 cDNA를 만들 재료가 사라져서 cDNA 합성 효율이 크게 떨어지게 됩니다.
그래서 소량의 RNase는 cDNA 합성이 끝난 후, cDNA와 결합된 불필요한 mRNA 잔해를 제거하는 용도로만 사용됩니다. 따라서, 원하는 cDNA를 성공적으로 얻기 위해서는 mRNA 주형을 보호하면서 불필요한 부분만 제거할 수 있도록 RNase의 양을 주의해야 합니다.
cDNA 합성 시 RNA 주형을 제거하는 과정에서 RNase를 과량 사용하면, 합성된 cDNA의 일부까지 분해될 수 있어 소량만 처리합니다. 이는 cDNA 합성 효소인 역전사 효소가 RNA 주형을 기반으로 cDNA를 합성하고, 이 과정 후에 주형 RNA를 제거해야 다음 단계의 반응이 효율적으로 진행되기 때문입니다. 따라서 주형 RNA만 선택적으로 분해하고 합성된 cDNA는 보존하기 위해 RNase의 양을 조절하는 것이 중요합니다.