학문
DNA 염기서열을 최초로 정확하게 읽어낼 수 있게 해준 생거 시퀀싱(Sanger sequencing) 기법이 궁금합니다.
DNA 염기서열을 최초로 정확하게 읽어낼 수 있게 해준 생거 시퀀싱(Sanger sequencing) 기법이 궁금합니다. 디옥시리보뉴클레오티드(ddNTP)를 이용해 DNA 합성을 특정 염기 위치에서 의도적으로 중단시키고 전기포형으로 크기를 읽어내는 원리가 알고 싶어요
3개의 답변이 있어요!
생거 시퀀싱은 1977년에 개발된 사슬 종결법 기반의 대표적인 DNA 염기서열 분석 기법입니다.
핵심 재료인 ddNTP는 3'-OH 대신 수소(3'-H)가 달려 있어 다음 뉴클레오티드와의 결합을 막습니다. DNA 합성 과정에서 중합효소가 무작위로 ddNTP를 편입시키면, 해당 위치에서 DNA 합성이 강제로 중단됩니다.
이로 인해 반응 튜브 안에는 끝부분이 각각 ddNTP(A, T, G, C)로 끝나는 다양한 길이의 조각들이 만들어집니다.
각 ddNTP에는 서로 다른 색상의 형광 물질이 붙어 있어 구분이 가능하고, 이 DNA 조각들은 모세관 전기영동 장치에 주입되어 크기별로 분리됩니다.
음전하를 띤 DNA는 크기가 작을수록 좁은 모세관을 더 빠르게 통과하고, 모세관 끝을 빠져나올 때 레이저가 형광을 인식하여 순서대로 파형을 기록합니다.
그래서 최종적으로 가장 짧은 조각부터 긴 조각 순으로 검출된 형광 색상을 읽어내면 전체 DNA 염기서열이 완성되는 것입니다.
참고로 현재도 99.99% 이상의 높은 정확도를 자랑하며 유전자 진단과 검증의 표준으로 쓰이고 있습니다.
채택된 답변안녕하세요. 생거 시퀀싱은 DNA를 구성하는 염기인 아데닌, 티민, 구아닌, 사이토신이 어떤 순서로 배열되어 있는지 알아내는 대표적인 염기서열 분석법인데요, 이 방법은 1970년대 프레더릭 생거가 개발했으며, DNA 합성이 특정 위치에서 멈추도록 유도한 뒤 생성된 DNA 조각들의 길이를 비교하여 염기서열을 알아내는 방식입니다.
DNA는 두 가닥이 서로 상보적인 염기쌍을 이루며, 새로운 DNA 가닥은 기존 가닥을 주형으로 삼아 합성됩니다. DNA 중합효소는 주형의 염기에 맞는 뉴클레오타이드를 차례대로 연결하는데, 이때 일반적인 디옥시리보뉴클레오타이드는 당의 3번 탄소에 수산기가 있어 다음 뉴클레오타이드와 결합할 수 있습니다. 반면 생거 시퀀싱에 사용하는 디디옥시리보뉴클레오타이드는 이 3번 탄소에 수산기가 없기 때문에, 이 물질이 DNA 가닥에 한 번 삽입되면 다음 뉴클레오타이드와 결합할 수 없어 DNA 합성이 더 이상 진행되지 않습니다. 실험에서는 분석할 DNA, DNA 합성을 시작하게 하는 짧은 프라이머, DNA 중합효소, 일반 뉴클레오타이드와 소량의 디디옥시뉴클레오타이드를 함께 넣습니다. DNA 중합효소가 새 가닥을 합성하는 동안 디디옥시뉴클레오타이드가 무작위로 삽입되면 그 지점에서 합성이 멈추며, 결과적으로 서로 다른 위치에서 합성이 중단된 다양한 길이의 DNA 조각들이 만들어집니다. 현대적인 생거 시퀀싱에서는 네 종류의 디디옥시뉴클레오타이드에 서로 다른 형광 표지를 붙여 어느 염기에서 합성이 중단되었는지 구분합니다.
이후 만들어진 DNA 조각들을 모세관 전기영동으로 분리하는데요, DNA는 인산기 때문에 음전하를 띠므로 전기장을 걸면 양극 방향으로 이동합니다. 길이가 짧은 조각일수록 모세관 내부를 더 빠르게 통과하고, 긴 조각일수록 상대적으로 늦게 도달합니다. 조각이 검출 지점을 통과할 때 형광 신호를 측정하면 가장 짧은 조각부터 긴 조각까지 각 조각의 마지막 염기를 순서대로 알아낼 수 있는데요, 이렇게 읽은 염기들을 차례대로 연결하면 새로 합성된 DNA 가닥의 염기서열을 결정할 수 있습니다. 단, 이것은 주형 DNA와 상보적인 새 가닥의 서열이므로 주형 자체의 서열을 구하려면 염기쌍 규칙에 따라 상보적인 서열 해석이 필요합니다. 감사합니다.
안녕하세요. 임형준 수의사입니다.
생거 시퀀싱은 DNA 합성 중 ddNTP가 들어가면 3'-OH가 없어 연장이 멈추는 원리를 이용합니다. 서로 다른 길이의 DNA 조각을 전기영동으로 크기순 분리하고, 끝 염기를 읽어 원래 서열을 결정합니다. 현재는 형광표지와 모세관 전기영동을 주로 사용합니다.