크리스퍼 카스9 유전자 가위 기술의 작동 원리와 정확도가 궁금해요

Question

최근 생명공학에서 핵심적인 유전자 교정 도구로 쓰이는 CRISPR-Cas9이 어떻게 특정 DNA 염기서열을 정확히 인식하고 절단하는지 알고 싶습니다. 가이드 RNA의 역할과 절단 후 세포 자체 복구 메커니즘을 통한 유전자 수정 원리가 궁금해요.

Answer 1

안녕하세요. CRISPR-Cas9은 쉽게 말하면 원하는 DNA 주소를 찾아가 그 부분을 절단하고, 세포가 DNA를 복구하는 과정에서 원하는 유전적 변화를 만들어내도록 하는 기술이라고 할 수 있습니다. 이때핵심은 Cas9 단백질과 가이드 RNA의 조합인데요, 가이드 RNA에는 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 서열이 들어 있어 일종의 주소 안내 역할을 합니다.

Cas9은 이 가이드 RNA와 결합한 상태에서 DNA를 탐색하다가 먼저 표적 주변에 있는 PAM이라는 짧은 서열을 확인합니다. 대표적인 Cas9에서는 PAM이 주로 NGG 형태이며, PAM이 적절하게 존재하면 그 주변 DNA를 풀어 가이드 RNA와 표적 DNA가 염기쌍을 형성하는지 확인하며, 이때 충분히 잘 맞으면 Cas9의 구조가 변하면서 DNA 두 가닥을 각각 절단해 이중가닥 절단을 만듭니다. 이후 중요한 것은 세포 자체의 DNA 복구 시스템입니다. 절단된 DNA는 그대로 있을 수 없기 때문에 세포는 이를 복구하려고 합니다. 대표적인 방법이 비상동 말단 연결과 상동성 유도 복구입니다. 비상동 말단 연결은 끊어진 DNA를 빠르게 다시 연결하는 방식인데, 이 과정에서 몇 개의 염기가 삽입되거나 삭제되는 경우가 많습니다. 이러한 작은 변화가 유전자의 정상적인 읽는 틀을 망가뜨리면 해당 유전자의 기능이 사라질 수 있어 유전자 녹아웃에 활용됩니다. 반면 상동성 유도 복구에서는 원하는 서열을 포함한 주형 DNA를 제공하면 세포가 이를 참고하여 보다 정확한 염기서열 변화나 삽입을 만들 수 있습니다. 다만 상동성 유도 복구는 세포의 종류와 상태 등에 따라 효율이 제한될 수 있습니다.

하지만 이때 CRISPR-Cas9이 원하는 곳만 정확하게 자르는 것은 아닙니다. 이 기술은 매우 정밀하지만 100% 완벽한 것은 아닙니다. 가이드 RNA와 DNA 사이에 염기가 일부 맞지 않더라도 Cas9이 결합하거나 절단할 가능성이 있기 때문입니다. 의도하지 않은 다른 위치가 편집되는 것을 오프타깃 효과라고 하며, 특히 PAM과의 위치 관계, 가이드 RNA와 DNA 사이의 불일치 정도, DNA의 주변 환경 등이 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 실제 연구나 치료에서는 가이드 RNA를 신중하게 설계하고, 편집 이후 표적 부위뿐 아니라 잠재적인 오프타깃 부위까지 분석하여 정확성을 확인합니다. 최근에는 이러한 문제를 줄이도록 Cas9 단백질이나 가이드 RNA를 개선한 다양한 기술도 개발되고 있습니다. 감사합니다.

Answer 2

안녕하세요. 임형준 수의사입니다.

CRISPR-Cas 9은 가이드 RNA가 목표 DNA와 상보적으로 결합하고, Cas9 단백질이 인접한 PAM 서열을 확인한 뒤 DNA를 절단하는 방식입니다. 이후 세포는 NHEJ로 삽입, 결실을 만들거나 HDR로 원하는 서열을 교정할 수 있습니다. 정확도는 높지만 오프타깃 가능성은 있습니다.

Answer 3

'크리스퍼 카스9'은 목표 DNA를 찾아 절단하고 세포 스스로 복구하도록 유도하는 유전자 교정 기술입니다.

'크리스퍼 카스9'은 DNA 분자 가위 역할의 Cas9 단백질과, 길잡이 역할을 하는 가이드 RNA(gRNA)로 구성됩니다.

먼저 Cas9이 표적 DNA 주변의 특정 결합 자리인 PAM 서열을 먼저 찾아 결합하는데, 만일 PAM 서열이 없으면 gRNA와 DNA의 상보적 결합이 이루어지지 않습니다.

그리고 PAM 결합 후 DNA 이중나선이 풀리며, gRNA의 20개 염기서열이 표적 DNA 가닥과 상보적으로 결합합니다.

이후 서열이 일치하면 Cas9의 HNH 및 RuvC 도메인이 활성화되어 DNA 이중 가닥을 모두 잘라내는 것입니다.

DNA가 잘리면 세포는 생존을 위해 복구 시스템을 작동시키는데, 연구자들은 이 복구 경로를 활용해 유전자를 교정하는 것입니다.

즉, NHEJ 복구(유전자 파괴)는 잘린 DNA를 즉시 붙이는 과정에서 염기 오류가 발생해 특정 유전자 기능을 비활성화하는 것이고, HDR 복구 (유전자 교정)은 공여 DNA 템플릿을 제공하면 상동 재조합을 통해 원하는 유전자 서열을 정확히 삽입하는 것입니다.