유전자 재조합에 성공했는지를 확인하기 위한 여부로 lacZ를 사용하는 원리는 무엇인가요?
안녕하세요. 대장균의 목적하는 DNA를 삽입시킨 플라스미드가 제대로 형질 전환되었는지, 유전자 재조합에 성공했는지를 확인하기 위한 여부로 lacZ를 사용하는 원리는 무엇인가요?
안녕하세요. 정준민 전문가입니다.
lacZ는 베타 갈라토시다아제를 만들며
삽입 DNA가 있으면 이 유전자가 불확성화되 엑스 겔에서 파란색 대신 흰색 콜로니가 생긴답니다.
안녕하세요. 네, 질문해주신 LacZ 유전자를 이용한 확인 방법은 Blue-White Screening이라고 불리는 유전자 재조합 확인 기법 중 하나입니다. 우선 lacZ 유전자는 β-galactosidase라는 효소를 코딩하고 있는데요, β-galactosidase는 특정 기질, 예를 들어 X-gal을 분해하면 푸른색 침전물을 생성합니다. 즉, lacZ가 기능적으로 발현되면 세포가 X-gal 배지에서 푸른색으로 나타납니다. 다만 유전자 재조합용 플라스미드에는 lacZ의 일부 영역이 포함되어 있는데요, MCS는 여러 제한효소 사이트를 포함하고 있어, 목적 DNA를 삽입할 수 있는 위치입니다.
따라서 목적 DNA가 MCS에 삽입되면 lacZ의 코딩 서열이 깨지게 되는 것이며 lacZ가 손상되면 β-galactosidase가 만들어지지 않아, X-gal을 분해하지 못합니다. 따라서 lacZ가 정상적으로 남아있는 플라스미드에서는 β-galactosidase가 생성되어 X-gal이 분해되기 때문에 세포가 푸른색을 나타냅니다. 반면에 lacZ가 목적 DNA 삽입으로 파괴된 플라스미드에서는 β-galactosidase가 없기 때문에 X-gal 분해가 불가능하며 이로 인해 세포가 흰색을 나타내는 것입니다. 감사합니다.
베타-갈락토시다아제의 활성 여부를 검사하여 확인할 수 있습니다.
lacZ 유전자는 베타-갈락토시다아제라는 효소를 암호화하는데, 이 효소는 X-Gal이라는 물질을 분해하여 푸른색을 띠게 합니다. 그리고 유전자 재조합 실험에서 목적 DNA를 삽입하는 플라스미드에는 lacZ 유전자 내부에 삽입 부위(MCS)가 있습니다.
만일 성공적으로 유전자 재조합이 이루어진 경우 목적 DNA가 lacZ 유전자 안에 삽입되어 lacZ 유전자가 파괴됩니다. 따라서 베타-갈락토시다아제가 만들어지지 않아 X-Gal을 분해할 수 없어 흰색 콜로니를 형성합니다.
반면 유전자 재조합이 실패한 경우 목적 DNA가 플라스미드에 삽입되지 않아 lacZ 유전자가 유지되고, 이로 인해 정상적으로 베타-갈락토시다아제가 생성되어 X-Gal을 분해하고 푸른색 콜로니를 형성합니다.
이러한 색깔 변화를 통해 유전자 재조합 성공 여부를 간편하게 선별할 수 있는 것입니다.
대장균에 목적 유전자를 성공적으로 삽입했는지 확인하기 위해 lacZ 유전자를 이용하는 원리는 형질 전환된 대장균이 X-gal이 포함된 배지에서 색깔 변화를 통해 나타나는 결과를 보는 것입니다. lacZ 유전자는 젖당 분해 효소인 β-갈락토시다아제를 만드는데, 이 효소는 인공 기질인 X-gal을 분해하여 파란색 물질을 생성합니다. 따라서 lacZ 유전자가 정상적으로 작동하는 대장균은 파란색 콜로니를 형성합니다. 반면, 플라스미드에 목적 유전자를 삽입할 때 lacZ 유전자가 그 사이에 끼어들어 기능을 잃게 되면 β-갈락토시다아제가 만들어지지 않아 X-gal을 분해하지 못하고, 결과적으로 흰색 콜로니를 형성하게 됩니다. 이러한 색깔 변화를 통해 유전자 재조합이 성공했는지 여부를 시각적으로 확인할 수 있습니다.