plasmid mini prep 할때 AW를 사용해야 하는 Cell line 에는 어떤것이 있나요?
plasmid mini prep 할때 column으로 옮긴다음 wash 단계에서 optional로 Aw로 씻는 단계가 있던데 왜 선택사항인지 어떤 cell line을 사용했을때 사용하는 단계인지 자세한 설명 부탁드립니다.
안녕하세요.
플라스미드 미니 프렘(mini-prep) 과정 중 선택적으로 사용되는 AW (Alkaline Wash) 단계는 특정 조건 하에서 세포로부터 플라스미드 DNA를 효과적으로 정제하는데 도움을 주는 과정입니다. 이 단계는 특히 세포 내에 RNA와 단백질이 풍부하거나 다른 불순물이 많을 때 사용됩니다. AW는 강염기성 용액을 사용하여 플라스미드 DNA와 염색체 DNA를 분리하고, 후자를 분해하여 순도 높은 플라스미드 DNA를 얻는데 기여합니다.
AW를 사용하는 경우는 일반적으로 고밀도로 배양된 세포나 특정 균주에서 DNA를 추출할 때 권장됩니다. 특히 세포 내에서 DNA, RNA, 단백질과 같은 성분들이 서로 강하게 결합하여 분리가 어려울때, AW 용액을 사용하면 이러한 결합을 효과적으로 파괴하고 각 성분을 효율적으로 분리할 수 있습니다. 그 예로, 고밀도 배양이 이루어진 대장균(Escherichia coli) 같은 세균 세포에서 이 방법이 종종 사용됩니다.
이와 같은 AW의 사용은 실험의 목적과 필요한 플라스미드 DNA의 순도에 따라 결정됩니다. 특히, 플라스미드를 이용한 후속 실험에서 높은 수준의 유전적 안정성과 효율이 요구될 때, AW 처리는 매우 유용할 수 있습니다. 이러한 처리는 플라스미드 DNA의 추출과 정제 과정에서 불순물의 영향을 최소화하고, 실험 결과의 신뢰성과 재현성을 높이는데 기여합니다.플라스미드 미니프렙 과정에서 Aw 버퍼를 사용하는 것은 일반적으로 선택 사항입니다.
이는 사용하는 키트, 세포주, 그리고 추출하고자 하는 플라스미드의 양과 순도에 따라 달라질 수 있습니다.
Aw 버퍼는 일반적으로 고염 농도를 가지고 있어, 단백질과 염을 효과적으로 제거하는 역할을 합니다.
이는 최종적으로 얻고자 하는 플라스미드 DNA의 순도를 높일 수 있는 것입니다.
그래서 높은 PCR이나 클로닝, 시퀀싱 등 후속 실험에서 높은 순도의 DNA가 요구될 때 Aw 버퍼를 사용하여 추가적인 정제를 진행하는 것입니다. 또는 특정 세포주 또는 플라스미드의 경우, 단백질 오염이 심할 수 있는데, 이러한 경우 Aw 버퍼를 사용하여 단백질을 효과적으로 제거할 수 있습니다. 또 만일 이전 단계에서 고염 농도의 버퍼를 사용했다면, Aw 버퍼를 사용하여 염을 제거할 수 있습니다.
그리고 사실 Aw 버퍼의 사용 여부는 세포주의 종류보다는 플라스미드의 양과 순도에 더 큰 영향을 받습니다. 일반적으로 단백질 발현량이 높은 세포주나 복잡한 세포벽을 가진 세포주의 경우 단백질 오염이 심할 수 있으므로 Aw 버퍼를 사용하는 것이 좋습니다. 하지만 모든 경우에 해당되는 것은 아니며, 실험 결과에 따라 유연하게 적용해야 합니다.
결론적으로, Aw 버퍼는 플라스미드 DNA의 순도를 높이는 데 효과적인 방법이지만, 무조건 사용해야 하는 것은 아닙니다. 실험 목적과 조건에 맞춰 적절하게 사용하는 것이 좋죠.
Plasmid mini prep에서 AW(Additional Wash) 버퍼는 잔여 단백질, 염, 또는 기타 불순물을 제거하기 위한 선택적 단계입니다. 이 단계는 특정한 cell line에 국한되지 않으며, 변형된 세포주나 높은 단백질 농도를 가진 샘플에서 더 깨끗한 플라스미드를 얻기 위해 사용됩니다. 예를 들어, DH5α와 같은 일반적인 플라스미드 생산 세포주에서는 필수가 아니지만, 특정 대장균 변종 또는 고단백질/염 농도를 포함하는 샘플에서는 결과 품질을 높이기 위해 권장됩니다. Optional로 분류된 이유는 모든 상황에서 반드시 필요하지 않기 때문입니다.